微科盟原创微文，欢迎转发转载。导读胃溃疡（GUs）是世界范围内普遍存在的消化系统疾病。吴茱萸汤（WZYT）是一种数百年来一直用于缓解消化不良和呕吐等消化系统疾病的中药。本研究旨在探讨WZYT对酒精性胃溃疡治疗的潜在作用及其潜在机制。我们采用宏观评价法计算胃溃疡指数（UI），采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测生化指标。病理组织分析包括苏木精-伊红（H&E）染色和过碘酸-雪夫（PAS）染色，以评估胃组织损伤。此外，网络分析和代谢组学的结合促进了潜在靶点的预测，并使用蛋白质印迹法进行验证。结果显示，WZYT能显著降低胃溃疡指数（UI）和调节酒精诱导的生化指标。此外，病理组织也有改善。网络分析结果表明，WZYT中含有62种化合物，通过调节183个基因来改善酒精诱导的胃溃疡。血清代谢组学显示WZYT处理后有19种代谢产物的含量发生了显著变化。通过构建“化合物-靶点-代谢物”网络，我们发现血红素加氧酶1（HMOX1）和白蛋白（ALB）这两个关键靶点在治疗胃溃疡中发挥着重要作用。免疫印迹分析证实WZYT具有提高HMOX1和ALB靶点表达的能力。因此，网络分析与代谢组学的结合为推进WZYT治疗GUs的临床应用提供了科学依据。本研究为吴茱萸汤治疗胃溃疡提供了理论依据。论文ID原名：Mechanism of Wuzhuyu decoction on alcohol-induced gastric ulcers using integrated network analysis and metabolomics译名：吴茱萸汤对酒精性胃溃疡作用机制的综合网络分析和代谢组学研究期刊：Frontiers in PharmacologyIF：5.6发表时间：2024.01通讯作者：赵艳玲，李浩田通讯作者单位：成都中医药大学，中国人民解放军总医院第五医学中心实验设计实验结果1. 胃黏膜的宏观评价与模型（M）组相比，空白（K）组胃黏膜完整，表面光滑，无出血。饮酒会导致严重的胃损伤，伴有出血性侵蚀、胃黏膜完整性破坏、黏膜充血和肿胀。WL组胃黏膜损伤明显减轻，出血呈条状，黏膜肿胀有明显改善。高剂量（WH）组的胃黏膜改善更为明显（图2A）。此外，我们测量了不同组的胃溃疡指数，结果表明WZYT能够显著降低UI水平（图2B）。图1 动物实验给药流程图2. WZYT对IL-6、IL-10、TNF-α的影响我们采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中IL-6、IL-10和TNF-α的水平。结果显示，饮酒后IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低。然而，WZYT显示出逆转这些指标的能力（图2C–E）。图2 WZYT对酒精性胃溃疡的影响（A）胃溃疡的宏观评估。（B）WZYT对不同组UI的影响。（C–E）血清中IL-6、IL-10和TNF-α的表达。数据表示为平均值±标准差（n=6）。与K组比较有显著性差异（#p<0.05、##p<0.01）；与M组比较有显著性差异（*p<0.05、**p<0.01）。3. WZYT对组织学的影响如图3A所示，K组的胃黏膜腺显示出完整且紧密堆积的结构。饮酒导致上皮细胞脱落，炎症细胞明显浸润，出血，损伤指数显著升高（图3B）；WL组和WH组均表现出病理学改善。与M组相比，WL组未出现明显出血。此外，PAS染色显示，由于酒精的作用，顶端染色显著减少，染色率也显著降低。WZYT增强了顶端染色强度，WH组的阳性率比WL组更明显（图3C）。以上结果表明，WZYT能有效改善胃组织病理学。图3 （A） WZYT对不同组病理变化的影响。HE：苏木精和伊红染色。PAS：用过碘酸-雪夫染色（×100和×200放大倍数）。（B）胃损伤指数HE评分。（C）PAS阳性率。数据以平均值±标准差（n=3）表示。#与K组比较有显著性差异（p<0.05、p<0.01）；与M组比较有显著性差异（*p<0.05、**p<0.01）。蓝色箭头：上皮细胞脱落；黑箭头：炎症细胞浸润；白色箭头：胃组织出血。T：顶端染色。4. 网络分析结果4.1 化合物与靶点预测利用TCMSP数据库和Swiss靶点预测数据库的信息，我们总共汇编了62种化合物。具体而言，吴茱萸（wzy）贡献25个成分，人参（rs）贡献17个成分，生姜（sj）贡献3个成分，大枣（dz）贡献17个成分。在使用UniProt数据库去除重复项并翻译为关键基因名称后，我们总共获得了295个基因靶点。“药物化合物靶点”网络如图4所示。图4 “药物化合物靶点”网络黄色圆圈代表wzy的化合物；红圈代表dz的化合物；蓝色圆圈代表rs的化合物；橙色圆圈代表sj的化合物；紫色代表共同的化合物；蓝色方块代表不同的基因。4.2 疾病靶点采集与预测我们从Genecard和OMIM数据库中筛选酒精性胃溃疡的疾病靶点。在Genecard数据库中，我们得到了1351个基因靶点；在OMIM数据库中，我们得到了114个基因靶点。重复数据消除后共获得1433个基因靶点。然后在维恩数据库筛选后，获得183个共同靶点（图5A）。为了更好地可视化活性化合物和疾病靶点之间的关系，我们建立了“化合物-靶点-疾病”网络，如图5B所示。表1显示了按degree排列的前3种化合物。表1 按degree排序的前3位化合物信息图5 （A）疾病维恩图和WZYT。（B）“化合物-靶点-疾病”网络。不同的颜色来自不同的药物。（C）蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（D）PPI网络的前10个靶点。4.3 PPI网络指示String数据库用于研究蛋白质相互作用（PPI）网络。我们将183个共同靶点输入String数据库，将生物体选为“智人”，并将所需的最低交互得分设置为最高置信度0.9。我们下载TSV文件，并使用Cytoscape 3.9.1进一步可视化。节点的颜色和大小按degree排序。如图5C所示，颜色越深，degree越高。JUN、AKT1、TP53、RELA、MAPK1、TNF、CTNNB1、MAPK14、FOS和IL6的前10个靶点被确定为核心靶点（图5D）。图6 （A）GO富集分析。（B）KEGG富集分析。4.4 基因本体(GO)和京都基因基因组百科全书(KEGG)富集分析GO分析的结果如图6A所示。GO分析显示了相关的生物学过程，包括基因表达的正调控、对缺氧的反应和炎症反应。细胞成分包括细胞外空间、质膜和细胞表面。分子功能包括酶结合、转录因子结合和一氧化氮合酶调节活性。对于通路分析，我们共获得173个通路，前20个KEGG分析富集结果显示了涉及癌症通路、脂质和动脉粥样硬化以及PI3K-Akt信号通路的相关机制（图6B）。图7 （A）“通路-靶点”网络的前20条路径。蓝色方块代表WZYT的靶点，紫色靶点代表WZYT和通路的共同靶点。黄色的“V”表示前20条路径。（B）cytoHUBBa分析的“关键靶点”网络。4.5 通路-靶点网络构建为了更深入地了解WZYT影响酒精诱导的胃溃疡的潜在机制，我们将前20个通路及其富集的靶点构建成“通路-靶点”网络（图7A）。随后，我们使用cytoHUBBa对“关键靶点”网络进行进一步分析。MCC分析结果强调了PI3K-AKT通路在酒精诱导的胃溃疡治疗方法中的关键作用（图7B）。图8 ESI-和ESI+模式下不同组的主成分分析（A）ESI-模式。（B）ESI+模式。5. 血清代谢分析5.1 多元统计分析我们对来自不同组的大鼠进行非靶向血清代谢组学分析。主成分分析（PCA）用于辨别K、M和WH组之间的聚类趋势；质量控制（QC）用于评估样品的稳定性。主成分分析结果表明，在负离子模式下存在显著的聚类；然而，在M组和WH组中，正离子模式的聚集趋势并不显著（图8）。我们对潜在结构进行正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），以确定不同组之间的差异代谢物。R2Y（um）和Q2（cum）通常用于描述模型拟合的水平。在负离子模式下，K和M组R2Y和Q2分别为0.960和0.859，M和WH组分别为0.990和0.934；在正离子模式下，K组和M组R2Y和Q2分别为0.971和0.865，M组和WH组分别为0.990和0.889。此外，我们通过200次置换检验验证了该模型的有效性。所给出的结果证明了当前模型的良好拟合率。此外，我们还利用S图来识别差异代谢物（图9）。图9 血清代谢组学分析结果（A，G）ESI-和ESI+模式下K组和M组的OPLS-DA分析。（D，J）ESI-和ESI+模式下M组和WH组的OPLS-DA分析。（B，H）ESI-和ESI+模式下的K组和M组的S图分析。M组和WH组在ESI-和ESI+模式下的（E，K）S图分析。（C，I）ESI-和ESI+模式中的K组和M组的200个置换检验。（F，L）M组和WH组在ESI-和ESI+模式下的200个置换检验。5.2 潜在代谢产物的鉴定根据OPLS-DA分析，代谢物满足VIP>1、|P（corr）|≥0.58和t检验P<0.05被确定为潜在的生物标志物。最终我们共获得19种代谢产物。随后，我们使用HMDB数据库对所有代谢物进行鉴定。其中，M组和K组之间有3种代谢产物下调，16种代谢产物上调。然而，WH组和M组的变化模式相反。代谢产物的变化如表2和图10所示。为了说明不同组之间代谢物的变化，我们创建了一个相关的热图（图11）。表2 代谢物在不同组间发生变化注：与K组相比，#p＜0.05、##p＜0.01；与M组相比，*p<0.05，**p<0.01。图10 不同代谢产物在K、M和WH组之间的变化趋势（A）2-羟基己二酸。（B）Leukotriene B4 ethanolamide。（C）Trihexosylceramide（d18:1/24:0）。（D）Docosahexaenoyl Ethanolamide。（E）水苏糖。（F） PC（2:0/5-iso PGF2VI）。（G）胆红素。（H）PC（22:5（7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/14:0）。（I）LysoPC（24:0/0:0）。（J）CL（10:0/1:0/i-13:0/i-22:0）。（K）CL（i-12:0/i-16:0/i-18:0/i-14:0）。（L）CL（10:0/a-17:00/a-17:0/a-17:0）。（M）Hexachlorotetracyclo。（N）PE（16:1（9Z）/14:1（9Z-））。（O）Nitrolinoleic acid。（P）Ganglioside GM3（d18:0/18:1（11Z））。（Q）PIP3（18:0/18:1（9Z））。（R）PIP（22:3（10Z，13Z，16Z）/TXB2）。（S）二甲酚草胺。数据表示为平均值±标准差（n=6）。与K组比较有显著性差异（#P＜0.05、##P＜0.01）；与M组比较有显著性差异（*p<0.05、**p<0.01）。5.3 代谢途径富集我们通过Metabioalyst 5.0富集所有代谢产物的途径。结果表明，共有7条途径包括甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚生物合成、半乳糖代谢、卟啉和叶绿素代谢，花生四烯酸代谢参与了酒精诱导的胃溃疡的调节。更多细节如表3所示。表3 代谢途径富集结果（使用MetaboAnalyst 5.0）6. 整合网络分析和代谢组学为了进一步阐明WZYT与潜在代谢物之间的可能机制，我们使用Cytoscape 3.9.1构建了一个“化合物-靶点-代谢物”网络（图12）。我们共鉴定出173个靶点，直接调节6种代谢产物。特别是对于WZYT，我们发现有51种成分直接调节183个靶点。此外，两个靶点，ALB和HMOX1，被确定为参与代谢调节和网络分析的共同靶点。图11 K、M、WH组不同代谢物热图7. 免疫印迹分析蛋白质印迹结果显示，酒精显著降低了ALB的表达。然而，WZYT给药逆转了酒精诱导的ALB下降（图13A）。对于HMOX1，酒精给药促进HMOX1活化作为对抗氧化应激损伤的保护机制。另一方面，WZYT能够增强HMOX1的表达以发挥其胃肠道作用（图13B）。图12 “化合物-靶点-代谢物”网络蓝色代表基因，橙色代表化合物，紫色代表代谢物，黄色代表常见靶点。图13 （A）ALB的表达。（B）HMOX1的表达。数据以平均值±标准差（n=3）表示。与K组比较有显著性差异（#p<0.05、#p<0.01）；与M组相比，*p<0.05，**p<0.01。酒精引起的胃溃疡已成为消化系统最常见的疾病之一，而且数量还在增加。与西药相比，中药具有安全性高、疗效好的特点。WZYT已经使用了数千年，在治疗消化系统疾病方面一直很有效。本研究旨在通过网络分析和血清代谢组学研究中药WZYT治疗酒精性胃溃疡的作用及其可能机制。酒精是一种强烈的刺激物，能够直接影响胃壁并导致胃黏膜损伤，这种损伤通常会导致凝血过程减弱导致出血。在本研究中，M组的胃黏膜表现出出血性侵蚀和严重的完整性丧失的特征。WZYT的给药有效地减轻了黏膜损伤，并导致UI水平降低。HE病理染色显示，饮酒引起腺体排列紊乱和炎症细胞浸润。PAS染色也显示酒精灌胃后顶端染色减少。这些现象与文献中先前的报道一致。WZYT的给药改善了病理组织状况，证实了其对胃黏膜的保护作用。除了对胃黏膜造成损伤外，酒精诱导的胃溃疡还促使急性炎症反应的发生，并改变了细胞炎症因子如TNF-α和IL-6的浓度。TNF-α是巨噬细胞分泌的一种炎症因子，在激活中性粒细胞和释放氧自由基方面起着关键作用。TNF-α的积累阻断血液微循环，加重胃黏膜损伤。此外，在酒精诱导的胃溃疡中，IL-6的炎症因子水平也显著增加，导致联接蛋白的分解，并进一步加剧胃黏膜损伤。值得注意的是，IL-10是生物体中一种典型的抗炎因子，先前的报道表明IL-10抑制促炎因子的释放。在我们的研究中，饮酒后TNF-α和IL-6水平均升高，IL-10水平下降。WZYT给药可逆转上述指标，表明其具有良好的抗炎特性。为了深入研究WZYT治疗酒精性胃溃疡的潜在机制，我们使用网络分析进行了分析。研究结果表明，PI3K-AKT通路与脂质代谢和炎症反应密切相关，在胃溃疡处理中发挥着关键作用。PI3K-AKT通路与细胞凋亡、细胞增殖和细胞迁移有关，在细胞上皮修复中发挥重要作用，先前的文献也证实了PI3K-AKT通路在胃溃疡中的激活。网络分析结果表明，PI3K-AKT通路的调节可能是WZYT改善酒精诱导的胃溃疡的一种重要方式，这一点有待进一步验证。此外，血清代谢组学揭示了各种脂质代谢在胃溃疡调节中的作用，如甘油磷脂代谢、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢，这些在以前的文献中已有报道。众所周知，脂质代谢是一种重要的代谢方式，受多种生理过程的调节，如癌症、糖尿病、动脉粥样硬化、炎症和其他自身免疫性疾病。酒精性胃溃疡作为一种典型的炎症反应，积极参与脂质代谢的调节。LysoPC是一种参与脂质代谢的脂质分子，是一种具有强大促炎作用的生物活性单甘油磷脂，与增强血管内皮通透性密切相关，这种物质的积累会导致胃溃疡的严重出血。我们的结果表明，lysoPC的水平在M组中增加，在WH组中降低，这证实了WZYT在调节脂质代谢产物方面的优异能力。综合网络分析和代谢组学，ALB和HMOX1被确定为共同靶点，随后我们进行了验证。ALB在人类和许多动物中普遍存在，在维持血液的胶体渗透压和各种离子的运输方面起着决定性作用。此外，由于其独特的生物结构，ALB起到氧自由基清除剂的作用，并表现出抗氧化特性。在我们的研究中，酒精处理后ALB水平显著下降，这与先前的文献一致。HMOX1是一种典型的抗氧化基因，可保护组织和细胞免受一系列挑战，包括缺血/再灌注损伤、氧化应激、炎症和细胞凋亡。它发挥抗氧化作用的机制是氧化剂转化为CO和胆红素。我们还证明了PI3K-AKT和HMOX1之间的相互串扰。在我们的研究中，我们证实了HMOX1的表达被激活，WZYT可以提高HMOX1表达以减轻胃黏膜损伤。我们的结果与以前的文献一致。结论该研究证明了WZYT在提高血清生化指标和减轻病理组织损伤方面的功效。网络分析表明，WZYT可能通过PI3K-AKT途径对酒精诱导的胃溃疡产生显著影响，这一点有待进一步验证。血清代谢组学强调了脂质代谢在调节酒精诱导的胃溃疡进展中的关键作用。网络分析和代谢组学的结合揭示了WZYT改善酒精性胃溃疡的多种途径和多个靶点。在未来，我们将验证更多可能的机制，如氧化、细胞凋亡和炎症。我们的研究提供了WZYT的新应用，以及中药研究的新策略。https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2023.1308995/full线粒体结合中医药直播课：多组学测序服务：1.代谢组学(非靶/靶向)：300起2.转录组测序：480起3.蛋白质组学：1500元起相关咨询，加微信：1278317307。【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。

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